El tamaño diminuto de la mayoría de las células bacterianas las vuelve prácticamente invisibles bajo un microscopio óptico. La principal complicación radica en la falta de contraste entre la célula y su entorno, y para superar este obstáculo, se recurre comúnmente a la aplicación de colorantes.
Estos compuestos se emplean para diferenciar entre distintos tipos celulares o para revelar la presencia de componentes específicos, como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares y centros de actividad respiratoria, entre otros.
Antes de la aplicación del colorante, las células suelen someterse a un proceso de coagulación del protoplasma, conocido como fijación. En el caso de bacterias, la fijación mediante calor es la práctica más común, aunque también se puede llevar a cabo con sustancias químicas como formaldehído, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, la adición del colorante no induce cambios adicionales en la estructura del protoplasma.
El procedimiento típico implica fijar las células en un portaobjetos, tratar este con el agente fijador y proceder inmediatamente con la tinción. La fijación tiende a provocar la contracción de las células, mientras que la tinción, por el contrario, las hace aparentar un tamaño mayor al real, lo que dificulta la precisión en las mediciones.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos con afinidad específica por los componentes celulares. Muchos de ellos son cationes que se combinan intensamente con componentes celulares cargados negativamente, como ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos. Ejemplos incluyen el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros actúan como aniones y se combinan con componentes celulares cargados positivamente, como la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo. Además, hay colorantes liposolubles que se unen a los lípidos celulares, como el negro Sudán.
En algunos casos, ciertos colorantes requieren el tratamiento previo de la célula con una sustancia llamada mordiente, como el ácido tánico. Este mordiente altera un componente celular de manera que facilite la acción del colorante. Si el objetivo es simplemente aumentar el contraste celular para la observación microscópica, se suelen utilizar procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un ejemplo de colorante eficaz que actúa rápidamente sobre todas las células bacterianas sin oscurecer excesivamente los detalles celulares, siendo especialmente útil en la detección de bacterias en muestras naturales, ya que la mayoría de los materiales no celulares no se tiñen.
La tinción negativa presenta un enfoque inverso al procedimiento convencional, ya que en este caso las células no se tiñen, sino que se colorea el entorno que las rodea. De esta manera, se obtiene una visualización del contorno de las células. El agente utilizado para esta tinción es un material opaco que carece de afinidad por los constituyentes celulares, limitándose a rodear las células. Ejemplos de sustancias empleadas en la tinción negativa incluyen la tinta china (una suspensión de partículas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). Aunque la tinción negativa resulta efectiva para aumentar el contraste en la microscopía óptica, su verdadera utilidad radica en la revelación de la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.
A pesar de la utilidad de los métodos de tinción, se debe utilizar con precaución, ya que existe la posibilidad de errores. En ocasiones, las moléculas de colorante pueden formar precipitados o agregados que se asemejan a estructuras celulares auténticas, pero que, en realidad, son formaciones completamente artificiales inducidas por el propio colorante. Estas estructuras se conocen como artefactos, y es crucial tomar precauciones exhaustivas para asegurarse de no cometer errores al interpretar un artefacto como una estructura realmente existente.
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